肠球菌耐药性分析及其耐药机制研究现状

肠球菌是条件致病菌,可导致人体多脏器的感染,不仅可引起尿路感染、皮肤软组织感染,还可引起危及生命的腹腔感染、败血症、心内膜炎和脑膜炎等。近年来抗菌药物的广泛应用,使肠球菌对多种抗菌药物产生耐药,已成为医院感染和二重感染的重要致病菌。近年来由于广谱抗菌药物的大量使用，肠球菌属作为条件致病菌所致的感染率持续升高，尤其对于那些有严重基础疾病、机体免疫力低下的患者，容易侵入体内或易位，导致局部或全身感染大多数肠球菌为多重耐药菌株。多重耐药肠球菌引发的严重或致命的感染已经成为临床医生面临的巨大挑战。肠球菌种类较多，引起人体感染的主要是屎肠球菌和粪肠球菌，合计约占95％。本文通过综合论述的方式，为探讨肠球菌耐药性分析及其耐药机制研究现状以指导临床合理用药提供理论依据。

1.肠球菌的概述及耐药性

肠球菌（Enterococcus）是革兰氏阳性球菌,形态一般为椭圆形或圆形,链状排列,无芽孢，无鞭毛,属于需氧和兼性厌氧菌。肠球菌在麦康凯琼脂平板上生长较好形成的菌膜较ＭＨ琼脂平板的厚，因其抑菌圈边界较清楚、明显，容易测定。肠球菌是动物和人类肠道的正常菌群成员之一,其数量仅次于大肠杆菌,通常不引起发病,现在是临床上一种重要的机会致病菌。由于肠球菌细胞壁厚,对多种抗菌药物具有固有耐药。如对低浓度氨基糖苷类、头孢菌素类、复合磺胺以及克林霉素等体外即使敏感，临床用药效果不佳。美国的统计数字表明，肠球菌是医院获得性菌血症的第三位病原菌，是医院获得性尿路感染和伤口感染的第二位病原菌。由于肠球菌对耐青霉素酶、头孢菌素的青霉素类、低浓度的氨基糖苷类抗生素和低浓度的克林霉素天然耐药，对氟喹诺酮、氯霉索、四环素、大环内酯类以及糖肽类等抗菌药物能够产生获得性耐药，这也是肠球菌引发的感染及其多重耐药性在持续增加的原因。因多重耐药肠球菌引发的致命或严重的感染已经成为临床工作面临的巨大挑战。

2.肠球菌耐药性的实验室常用的检测方法

药敏试验主要用于：①帮助临床医师选择效果最佳的药物进行感染性疾病的治疗，以避免由于抗菌药物使用不当造成的许多不良后果；②进行流行病学调查；③药敏试验结果还可以用来做某些细菌的鉴定；④指导有关部门制定流行耐药菌的防治措施。

2.1.纸片扩散法(K-B法)

目前常用的方法，是一种半定量的方法。 美国NCCLS纸片扩散法敏感试验分委会所推荐的标准方法是以Bauer-Kirby建立的K-B法，是目前公认的标准实验方法。

原理：抑菌圈的大小可以反映待检菌对测定药物的敏感程度，与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。

2.2.稀释法

体外定量测定抗菌药物抑制待测菌生长活性的方法。根据稀释培养基的不同，分为肉汤稀释法和琼脂稀释法。琼脂稀释法是细菌药敏试验的金标准。 稀释法所测得的某抗菌药物抑制待测菌生长的最低浓度为最低（或最小）抑菌浓度（MIC），稀释法也可测定最小杀菌浓度（MBC）。其中肉汤稀释法是以水解酪蛋白（M-H）液体培养基将抗菌药作不同浓度的稀释，然后接种待测菌，定量测定抗菌药物抑制该菌的最低浓度（MIC）或杀死该菌的最低（或最小）杀菌浓度（MBC）。琼脂稀释法是将待测菌接种于含不同浓度药物的琼脂平板上，经培养后观察菌落的生长情况，以能抑制细菌生长的最低药物浓度为该菌的最低抑菌浓度。

E-test法是稀释法与扩散法相结合的一种方法，直接定量试验。把含有干燥的稳定的药物塑料条贴在琼脂平板的表面，经培养在一定范围抑制细菌生成，形成抑菌环。

3.肠球菌的耐药机制

近年来,细菌耐药性的监测研究重点包括:(1)耐甲氧西林的葡萄球菌和耐氨基糖苷类抗生素的多重耐药的葡萄球菌;(2)耐万古霉素的多重耐药的肠球菌;(3)耐β内酰胺类和大环内酯类的多重耐药的肺炎链球菌;(4)产超广谱β内酰胺酶及AmpC酶的革兰阴性杆菌;(5)非发酵糖菌群的多重耐药问题等。

其中肠球菌耐药机制包括由染色体基因决定的固有耐药、由染色体外的遗传单位如质粒、转座噬菌体、转座因子等携带DNA片段导致的获得性耐药。

3.1.肠球菌对β-内酰胺类抗生素耐药机制

肠球菌对β-内酰胺类抗生素的耐药主要归因于低亲和力PBPs的产生量及其氨基酸的改变,少数菌株产生β-内酰酶,极少数菌株耐药可能通过其它途径。深入研究肠球菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制,有助于新型抗生素的研发,有利于建立新的分子生物学方法快速检测菌株的耐药基因,能及时为临床选药治疗提供依据。对产β-内酰胺酶耐药菌株可选用含酶抑制剂的氨苄西林等复合抗生素治疗。了解肠球菌对β-内酰胺类抗生素耐药基因型的流行状况,对控制医院感染很有意义。  

3.2.肠球菌对氨基糖苷类抗生素耐药机制

耐氨基糖苷类高水平肠球菌(HLAR)是医院感染的重要病原菌，氨基糖苷类修饰酶(AME)是肠球菌对氨基糖苷类高水平耐药的主要机制，其中N-乙酰转移酶(AAC)、O-核苷转移酶(ANT)和O-磷酶转移酶(APH)是参与耐药基因表达的主要氨基糖苷类修饰酶类。

自从1979年以来Evance首次报道高耐庆大霉素肠球菌，肠球菌对庆大霉素，链霉素等氨基糖苷类药物的高水平耐药( HLAR)逐渐增加;林奇龙，夏邦世等［4］报道肠球菌属高浓度庆大霉素耐药株(HLGR)和高浓度链霉素耐药(HLSR)菌株比例已高达75.1% ，及陈育华，周碧云等［5］对 218株粪肠球菌的临床分布及耐药性分析，结果显示粪肠球菌高单位庆大霉素和高单位链霉素该菌耐药率分别达到61.0%和41.7%。肠球菌被高水平氨基糖苷类耐药时，则这种氨基糖苷类与β-内酰胺类的协同作用就不再存在［6］，也就导致了临床上联合用药治疗严重感染的失败。氨基糖苷类抗生素的作用主要是抑制细菌蛋白质的合成，作用点在细胞30S核糖体亚单位的16SrＲNA解码区的A部位，这种作用可能会影响细菌蛋白质合成的全过程，妨碍初始复合物的合成，诱导细菌合成错误蛋白以及阻抑已合成蛋白的释放，从而导致细菌死亡。

3.3 .肠球菌对喹诺酮类抗生素耐药机制

氟喹诺酮类抗菌药是全合成广谱抗菌药,具有抗菌谱广、抗菌作用强、生物利用度高、组织渗透性好和不良反应少等诸多优点,因而在临床广泛使用。随着环丙沙星、氧氟沙星等氟喹诺酮类抗菌药广泛应用于临床,在药物选择性压力作用下,肠球菌对该类药物的耐药性迅速增长。

肠球菌对氟喳诺酮类药物耐药主要涉及两种机制:一parC基因或gyrA基因突变导致靶位改变;二多重耐药外排泵对药物主动泵出导致细胞内药物浓度减少。多重耐药外排泵介导的肠球菌主动泵出氟哇诺酮类药物仅见于国外学者对个别敏感实验菌株的研究,但肠球菌临床株对氟喳诺酮类药物耐药和主动泵出机制的关系未见报道。靶位改变机制国内未见研究报道。

3.4肠球菌对大环内酯类抗生素耐药机制

 

肠球菌对大环内酯类的耐药包括erm基因介导的药物靶位的改变和mef基因介导的抗生素的主动外排等。erm基因位于接合型或非接合型转座子内,或由质粒携带,并常与其他耐药基因连锁,特别是四环素耐药基因。接合型转座子宿主广泛,可能是临床上许多不同种属的细菌携带有这种基因的原因。erm基因编码的蛋白质Erm是一系列相似的甲基化酶,以S-腺苷蛋氨酸(SAM)为甲基供体,催化23S rRNA的单个腺嘌呤成为N6-甲基或二甲基-腺嘌呤,影响23S rRNA和MLSB药物结合的空间结构,减少药物与靶位点结合,拮抗抗菌作用。肠球菌含有4～ 6个rRNA操纵子,目前尚未发现因23S rRNA碱基突变造成肠球菌对大环内酯类耐药。已发现erm基因家族有20余种基因亚型,在肠球菌中的erm基因主要为ermB,ermB的存在与肠球菌的高耐药水平(红霉素MIC≥ 32mg L)相关。最近,国外学者的体外实验证实,将耐红霉素的化脓性链球菌中的ermA基因通过接合的方式转给原先对红霉素敏感的化脓性链球菌、粪肠球菌和李斯特菌属,结果后3种菌均转变为对红霉素耐药。至今未发现能够灭活大环内酯类抗生素的肠球菌。在肠球菌中发现的mef基因为mefE。mefE基因编码的蛋白质Mef E属于转运蛋白的主要易化超家族(major facilitator su-perfamily,MFS),以质子泵为动力,可以把抗生素泵出细胞,使细胞内抗生素浓度降低引起耐药。目前认为,msrC基因具有特异性,只存在于屎肠球菌的染色体上,具体功能等进一步研究。

3.5肠球菌对唑烷酮类药物耐药机制

利奈唑胺作为唑烷酮类药物的一种，新创的结构以及与其他已知药物的不同作用机制，使其对临床上愈演愈烈的革兰阳性菌所致感染起到极其显效的作用，并得以推广。特别是诸如耐万古霉素肠球菌引起的感染，有很好的抗菌治疗效果。自2007年被批准进入我国以来，在全国各大医院的抗菌方面，发挥着巨大的作用，它使临床上很多耐药细菌需要复合多种抗生素这一问题得到一定的解决。目前已被批准用于治疗多种感染性疾病，在治疗效果上崭露头角，特别是近年来逐渐上升的肠球菌感染，尤其是反复出现的耐万古霉素的肠球菌感。但是随着利奈唑胺的大量应用于临床，临床分离的肠球菌关于利耐唑胺的耐药现象还是不断出现。

肠球菌对利奈唑胺耐药最常见的原因是23ＳｒＲＮＡ基因第5功能区发生核苷酸突变；Ｌ3和Ｌ4核糖体蛋白氨基酸的改变与利奈唑胺敏感性降低有关；ｃｆｒ基因可通过水平转移导致细菌同时对酰胺醇类、林可酰胺类、恶唑烷酮类、截短侧耳素类和链阳菌素Ａ类等5种药物耐药；最近发现的ｏｐｔｒＡ基因，除了可导致利奈唑胺耐药还可以使新型恶唑烷酮类药物泰地唑利的ＭＩＣ值明显升高。近年来利奈唑胺耐药肠球菌有增加的趋势，由于上述机制引起的利奈唑胺ＭＩＣ值大多介于4－8ｐｇ／ｍｌ，导致常规临床微生物检验工作中容易造成漏检，因此肠球菌中利奈唑胺耐药性的监测和研宄需引起更多的关注。

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